WB过程中常见的问题及可能原因分析

问题

可能原因

验证或解决办法

背景高

膜没有完全均匀湿透

使用100% 甲醇浸透膜5-10min

洗膜不充分

增加洗液体积和洗涤次数

阻断不充分

增加封闭液孵育时间,或者提高温度。选择合适的封闭试剂(脱脂奶粉,BSA,酪蛋白等)

二抗浓度过高

降低二抗浓度

检测过程中膜干燥

保证充分的反应液,避免出现干膜现象

曝光过度

缩短曝光时间

抗体与阻断蛋白有交叉反应

检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性,选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应

没有阳性条带,或者阳性条带比较弱

抗体染色不充分

增加抗体浓度,延长孵育时间

酶失活

直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物

标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

设置阳性对照,如果阳性对照有结果,但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。

试剂不匹配

一抗与组织种属,一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性

一抗失效

选择在有效期内抗体;并选择现配现用的工作液

HRP抑制剂

所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠

膜没有完全均匀湿透

使用100%甲醇浸透膜

靶蛋白分子量小于10Kd

选择小孔径的膜,缩短转移时间

甲醇浓度过高

过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离,从而沉淀在凝胶中,同时会使凝胶收缩或变硬,从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替

转移时间不够

对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间

抗体染色不充分

增加抗体浓度,延长孵育时间

标本中靶蛋白含量太低

增加标本上样量。

HRP抑制剂

所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠

抗体活性降低

选择在有效期内的抗体,工作液现配现用,避免长时间放置

封闭过度

减少封闭剂的量或缩短时间;换用不同封闭剂类型

曝光时间过短

延长曝光时间

条带位置不对;或有非特异性条带

色带)

二抗的非特异性结合

增加一个对照:不加一抗,其他操作过程不变,即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗(特异性更强的,只针对重链的)

一抗的特异性不够

使用单克隆或者亲和纯化的抗体,保证抗体的特异性

蛋白降解

使用新鲜制备的标本,并使用蛋白酶抑制剂

二聚体或多聚体存在

增加蛋白质变性过程及强度

抗体浓度过高

降低抗体(一抗、二抗)浓度,可以减少非特异性条带

蛋白上样量过大

降低上样量

封闭剂中有聚集体

使用前过滤封闭试剂

HRP耦联二抗中有聚集体

过滤二抗试剂,去除聚集体

HRP含量过高

降低酶联二抗的浓度

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